近日，福建农林大学资源与环境学院周顺桂教育团队在Nature Communications (IF=16.6)上发表了题为“Evolution of triclosan resistance modulates bacterial permissiveness to multidrug resistance plasmids and phages”的商酌效能。本商酌通过细菌进化本质（evolutionary ramp）、全基因组测序和基因敲除考据等技术，探究契机致病菌--肺炎克雷伯菌在握住普及的三氯生（triclosan，TCS）浓度恫吓下病原菌对TCS耐药的进化经由及分子机制。商酌阻挡标明，进化菌株（triclosan resistance mutants，TRMs）不仅对 TCS 高水平耐药（MIC普及4-128倍），同期对临床进攻抗生素产生了交叉耐药，其中包括环丙沙星nt 动漫，磷霉素和头孢噻肟的耐药水平普及4-16倍。更为进攻的是，TRMs菌株显赫普及了对四种高风险耐药质粒的联结升沉效能，且增强了对噬菌体的明锐性。四肢主要的突变基因，nsrR基因的敲除普及了肺炎克雷伯菌对四种AMR质粒的吸收率。该商酌从细菌分子进化突变和对耐药质粒的水平升沉调控的双重耐药机制，进展环境压力对细菌耐药产生和 ARGs 传播的重要影响。该商酌发现加深了对环境压力促进AMR环球传播至极机制方面的意志和交融。
小序
抗微生物药物耐药性（AMR）已成为发病率和死字率的主要原因，2022年Lancet论文诠释指出，在2019年204个国度和地区由于AMR导致的死字东谈主数高达495万东谈主。东谈主们普遍合计抗生素的过度使用加重了环球AMR职守。越来越多的凭证标明，包括消毒剂在内的非抗生素类杀菌化合物也会盘曲导致抗生素耐药性。举例，三氯生（TCS）是一种具有广谱抗菌活性的杀菌化合物，被浩荡应用于肥皂、牙膏等2000多种日用品中，其残留在水体、泥土等环境中均有检测到。据干系文件报谈，TCS耐药性加多与细菌对其他抗生素的耐药性升高存在径直的关系。本商酌以三氯生（TCS）四肢环境恫吓因子，探究其对细菌耐药性进化的影响，尤其是招架生雅故叉耐药的机制，尚不解晰。通过本项商酌，咱们计议了TCS长远下的细菌相宜性进化，以及它如何通过染色体基因突变或调控耐药质粒的水平升沉率，从而普及细菌的高水平耐药。因此，咱们通过本质室进化法探究肺炎克雷伯菌 Kp85在11天TCS的长远下（浓度从0.03 mg/L渐渐普及到32 mg/L），哄骗MIC法、荧光共聚焦、基因组测序和基因敲除等枢纽磨砺进化细菌对 TCS 和抗生素的耐药性变化，以及细菌对耐药质粒的联结升沉率、噬菌体的明锐性的影响。图文导读
（1） 高浓度的三氯生加快了肺炎克雷伯菌Kp85耐药性的进化
为了商酌TCS耐药性的赢得，咱们进行了“Evolutionary ramp”进化本质，将TCS明锐(MIC 0.5 mg/L)肺炎克雷伯菌Kp85菌株(Kp85anc)在96孔板上谈论培养11天，渐渐加多TCS浓度，其中TCS的浓度从0.03 mg/L每天迟缓加多至 32 mg/L，直到细菌不行再孕育。当TCS浓度普及到1 mg/L之后，细菌存活率握住着落(图1a)。为了信服TCS的耐药水平，从第7天到第10天的存活群体中悉数分离出13个TCS进化菌株(triclosan resistant mutants， TRMs)。MIC本质发现TCS耐药性加多4至128倍（图1e）。共聚焦激光扫描显微镜还不雅察到在8 mg/L TCS长远下，进化菌d10-2的死细胞数目（25.6%）低于亲本菌株（64.6%，图1c-d）。这些阻挡标明，肺炎克雷伯菌赶快进化出对TCS的高水平耐药性。
图1：a. 在三氯生浓度握住加多的情况下，细菌存活的数目和百分比（n = 15）；b. 每天细菌OD600nm值的变化；c-d共聚焦激光扫描显微镜下，比较进化菌和亲本菌株对TCS的耐药情况；e. TRMs对三氯生(TCS)、头孢噻肟(CTX)、磷霉素(FOS)和环丙沙星(CIP)的明锐性。
（2）揭示进化细菌普及对耐药质粒的联结升沉率
为了揭示细菌耐药性进化的分子机制，咱们选取7株进化菌株进行基因组测序和基因突变分析(图2a)。大大批的进化菌株佩戴nsrR基因和ndh突变，这两个基因齐与细菌应激反应干系。nsrR属于转录救援因子Rrf2眷属，与一氧化氮反映干系，而NADH氧化酶编码基因ndh已被报谈通过减少 NADH 氧化并加多细胞内的NADH浓度来加多AMR。值得防备的是，通过转录组学测序分析发现d10-2细菌防备系统干系基因的抒发下调(图2b)。细菌防备系统的下调可能会影响可出动基因元件（MGEs）的水平升沉，因此，咱们假定d10-2可能加多对AMR质粒的联结升沉率。为了考据这一假定，咱们哄骗联结升沉本质比较七株TRMs对AMR质粒的秉承身手，其中包括了流式细胞分析法和平板计数法。如图2d-e所示，在两种不同的测定枢纽下，大大批TRMs菌株对四种不同的AMR质粒的升沉率均显赫高于亲本菌株Kp85anc，标明TCS耐药性的进化促进了细菌对AMR质粒的水平升沉率。
图2：a. 7株进化细菌的突变基因图谱。灰色环代表亲本菌株，粉色和蓝色环代表第7天和第10天的进化菌；环上的圆点表现非同义突变。b. 与细菌防备系统干系的基因抒发的相对抒发水平；c. 接合升沉本质暗示图；d-e 采用涂布(d)和流式细胞术(e)的枢纽计较耐药质粒在亲本菌株和进化菌株中的接合升沉频率
（3）nsrR基因对AMR质粒的升沉效能的调控作用
nsrR基因属于Rrf2眷属的转录救援因子，梗概调控靶向DNA的联结，它可能会影响细菌对耐药质粒的联结升沉效能。为了考据这一假定，咱们不雅察不同的联结时辰，比较四个Kp85变异菌株（Kp85anc、d10-2、ΔnsrR和互补克隆ΔnsrR-c），对IncF耐药质粒的联结升沉水平。如图3a所示，联结升沉时辰和不同的变异株对pFII质粒的升沉速度有显赫影响(two-way ANOVA， F(15，40)=4.121，P=0.0002)。与亲本比较Kp85anc，d10-2在4、6、8和16h阐扬出更高的联结升沉率 (图3a，t-磨砺：P<0.05)；ΔnsrR敲除株在6、8、16和24h也有近似的阐扬 (图3a，t-磨砺：P <0.05)。此外，咱们还考据了其他三种不同AMR质粒的联结升沉率，与Kp85anc菌株比较，d10-2和ΔnsrR突变体的升沉率更高(图3b-c， t-磨砺，P <0.05)。该发现标明nsrR基因在一定进程上梗概普及细菌对AMR质粒的水平升沉率。
图3: a. 在不同的联结时辰点，哄骗流式细胞仪比较分析敲除菌株对IncF质粒的联结升沉效能；b-c.分歧用流式细胞仪和选拔性琼脂平板法测定细菌对其他三种耐药质粒的接合升沉率。
（4）nsrR基因调控肺炎克雷伯氏菌特异性噬菌体的明锐性
为了探究nsrR基因是否调控噬菌体的明锐性，咱们哄骗双层琼脂法和成斑法（spot assays）定性和定量的比较了四种不同的 Kp85变体对肺炎克雷伯菌特异性裂性噬菌体的明锐性。噬菌体雀斑测定夸耀，与Kp85anc (n = 36)比较，在d10-2 (n = 54)和ΔnsrR (n = 50)敲除株梗概被更多噬菌体侵染。与此同期，d10-2和ΔnsrR的成斑率普及约1000倍，标明防备系统的抒发裁汰以及nsrR的敲除均影响噬菌体侵染和复制。这些发现标明，三氯生耐药性的进化使菌株Kp85更容易受到噬菌体的影响。
图4：a. 用双层琼脂平板法测定四种Kp85变异株对不同噬菌体的明锐性（成斑形式及数目）；b. 定量比较不同的Kp85菌株对噬菌体的成斑率（phage forming unitnt 动漫，PFU/mL）; c. 热图比较了亲本、进化突变体和基因敲除突变体对54种裂性噬菌体的明锐性，ΔnsrR-c和Δndh-c分歧表现敲除ΔnsrR和Δndh的互补克隆。
